作者：曹慧珍 

“相分離”物理化學領域中的基本概念，這一現象可追溯至鴻蒙初始，盤古開天辟地，清者上升為天，濁者下沉為地。“相分離”也是生物學研究領域的熱詞，CNS2018年已發表多篇相關報道。細胞中的相分離，細胞內特定分子聚集起來形成液滴形成特定環境加速生物學反應，具有重要的生物學意義。小編不是科研工作者，就不班門弄斧給大家科普“相分離”的重要意義了，大家可以去查閱相關文獻。小編是顯微鏡工作人員哦，可以給大家提供相分離結構研究過程中顯微鏡圖像采集的技術支持！

1. 相分離的基礎----確定蛋白質形成液滴的濃度以及液滴的尺寸
這也是顯微鏡成像中的基礎篇哦，設置好成像光路（根據蛋白的熒光標記+TD），采集不同濃度樣品的熒光和透射光成像即可。

1.1選擇物鏡（根據物鏡型號確定是否加油加水），點擊OC在顯微鏡目鏡下確認樣品位置和焦面。 

*相變的尺寸是微米級的，所以通常情況下直接選擇60X或100X油鏡；但對于初學者或者底部厚度>0.17mm的器皿，選擇20X物鏡，通過zoom后續放大。 

1.2點擊A1切換至共聚焦顯微鏡成像，點擊[Laser Inter Locked]按鈕，解除閃爍狀態，使激光可以通過軟件解除鎖定。 

1.3點擊打開光路設置窗口

1.4勾選需要的通道（根據蛋白標記的熒光信號），如果觀察多種蛋白相分離，根據不同蛋白標記勾選多個通道，點擊按鈕，透射光檢測器進入光路，同時獲取透射圖像。 

*多通道圖像采集時，需注意通道順序Ch Series，為避免串色，建議選擇line4?1順序采集模式，如多色熒光相互之間確定不會串色，可選擇none模式，提高采集速度。 

1.5在Pinhole的項目中點擊[▲Home]按鈕，選擇與物鏡最匹配的針孔尺寸。 

1.6調整像素數為所需要的分辨率（512×512或1024×1024等），選擇掃描速度（信號較弱時，可降低掃描速度，提高信號亮度）。 

1.7點擊[Live]按鈕，先調節至最佳焦面，然后邊觀察圖像邊調節激光功率和檢測器的靈敏度HV。 

*提高Laser和HV都可提升圖片亮度，但HV過高，噪音增加，信噪比會降低，Laser過高，會帶給樣品光毒性，不利于多次圖像采集，請根據實驗目的，合理調整Laser和HV獲得最佳成像效果。 

1.8根據需要選擇Average，提升信噪比。 

1.9點擊[XY]按鈕以獲取圖像。 

1.10菜單欄中選擇[File] -> [Save As]保存圖像。

2. 液滴融合或分離實驗 

timelapse時間序列圖像采集

2.1重復1.1-1.6 

2.2打開PFS完美聚焦系統，較正熱漂移帶來的焦面變化，保證長時間拍攝焦面穩定性。 

2.3點擊[Live]按鈕，先調節至最佳焦面，然后邊觀察圖像邊調節激光功率和檢測器的靈敏度HV。 

2.4根據需要選擇Average，提升信噪比。 

2.5進入ND Acquisition窗口，勾選T 

2.6設置時間間隔（Interval）和持續時間（Duration），Interval需大于單張圖像采集時間。 

2.7勾選[Save to File]，在采集圖像的同時保存圖像。 

2.8點擊[Run now]按鈕，獲取時間序列圖像。 

*若液滴運動速度較快，可將Interval設置為no delay，并可通過降低圖像分辨率和不選擇Average保證采集速度盡量大。 

*若液滴容易淬滅，保證亮度信噪比的同時盡量降低激光強度，對于運動較慢的液滴可以設置較長的Interval間隔來降低采圖對于熒光染料的淬滅。 

Nott, T. J. et al.

3. 細胞或離體環境中液滴的分布 

三維序列圖像采集

3.1重復1.1-1.8 

3.2進入ND Acquisition窗口，勾選Z 

3.3點擊[Live]按鈕，邊預覽邊調節焦面至信號消失，點擊[Top]按鈕，確定三維圖像的頂面 

3.4繼續預覽，反方向調節焦面，信號增強再減弱至消失，點擊[Bottom]按鈕，確定三維圖像底面，停止預覽。 

3.5輸入Step，建議選擇推薦值的1-2倍。 

3.6勾選[Save to File]，在采集圖像的同時保存圖像。 

3.7點擊[Run now]按鈕，獲取三維序列圖像。 

3.8點擊[Show Volume View]按鈕，構筑三維圖像。用鼠標拖動三維圖像的邊框，以調節到所需的角度。從菜單欄中執行[Edit] -> [Create View Snapshot (8bit RGB)]，獲取特定角度的圖像。
3.9點擊[Show Movie Maker]按鈕，開始創建旋轉圖像，旋轉拖拉右側各種旋轉模塊進入時間軸，然后點擊[Create Movie]按鈕創建影像。從菜單欄中選擇[File] -> [Save As]將創建的動畫保存為avi。

4. 通過FRAP實驗研究相分離結構與周圍環境的物質交換 

4.1重復1.1-1.6 

4.2打開PFS完美聚焦系統，較正熱漂移帶來的焦面變化，保證長時間拍攝焦面穩定性。 

4.3點擊[Live]按鈕，先調節至最佳焦面，然后邊觀察圖像邊調節激光功率和檢測器的靈敏度HV。 

4.4點擊圖像側面邊框上的按鈕，在圖像上繪制ROI。 

4.5在ROI上鼠標右擊，從彈出的菜單中選擇[Use as Stimulation ROI]。

4.6點擊Photo Activation，切換設定畫面。選擇刺激用的激光及激光功率，選擇刺激的掃描速度。 

4.7點擊 [Photo Activation]按鈕，啟動ND Stimulation窗口。

4.8在ND Stimulation窗口設置FRAP程序，通常我們先添加一條采集程序，采集2-3張漂白前的圖像（no delay），然后增加一條刺激程序，該程序的ROI編號需于4.5中一致，最后我們添加一或多條采集程序（采集漂白后恢復圖像），Interval和Duration取決于液滴熒光的恢復速度及抗淬滅能力。 

4.9點擊[Apply Stimulation Settings]按鈕，讀取光刺激成像的設定。可勾選[Perform Time Measurement]在獲取圖像的同時獲取ROI內熒光信號的時間序列變化圖。 

4.10點擊 [Run now]按鈕，執行光刺激成像，獲取FRAP圖像。 

*FRAP實驗不是一蹴而就的，整個ND stimulation包含三條及以上程序，#1是約定俗成的采集2-3張圖像，記錄漂白前的圖像，#2和#3都是需要不斷嘗試的。 

#2決定了樣品能否被漂白，漂白到什么程度，#3反映了漂白區域的熒光信號恢復速度。在沒有相關實驗參考的前提下FRAP圖像采集建議： 

a) 按照以下程序run：刺激用激光功率先設定為100%，刺激速度1s/f，#1 acquisition  no delay 2 loops，#2 stimulation S1 no delay 1 loops，#3 acquisition  no delay 2 loops。 

b) 根據上述結果圖像，判斷ROI區域是否被漂白，漂白效率是多少，漂白區域是否與ROI區域匹配。若未被漂白或漂白效率不足50%，需提高漂白時間，通過提高Scan speed或#2中loops都可；若漂白效率高于95%或漂白區域大于ROI區域時，需降低刺激時間或刺激光的強度，因#2中loops為1僅可通過降低Scan speed降低漂白時間；多次測試后獲取最佳漂白參數。 

c) 修改#3， acquisition  no delay  duration5min，采集一組圖像，判斷樣品信號的恢復速度以及抗淬滅能力。若樣品恢復速度非常快，10s內需要調整Scan setting，犧牲一部分圖像分辨率以最快的速度采集圖像；若樣品恢復速度較慢，可設置interval，減少光毒性和數據量；若信號的恢復速度慢且易淬滅，首先需要調整Acquisition參數，降低Laser提高HV，然后必須提高Interval間隔時間。 

d) 如想一次性漂白多個區域，建議ROI分別Use as Stimulation ROI 1、2、3而非都Use as Stimulation ROI 1，如果使用后者無法使用一個ROI摸索出的漂白參數，漂白效果未知，還需注意在Photo Activation窗口下勾選all stimulation area set to same，#2中ROIs選擇S1,S2,S3。

Sun D, Wu R, Zheng J, Li P, Yu L. Cell research 2018;28:405-15.采集自本平臺

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