工作原理：

正常細胞的表面由不對稱分布在質膜內葉和外葉上的脂質組成。這些脂質之一磷脂酰絲氨酸（PS），通常僅分布于質膜的內葉，因此僅暴露于細胞質中。然而，在細胞凋亡過程中，脂質不對稱性消失并且PS暴露在質膜的外部小葉上。 Annexin V是一種36 kDa的鈣依賴性的磷脂結合蛋白，能夠與PS結合。因此，熒光標記的Annexin V可用于檢測暴露于早期凋亡細胞外部的PS。Annexin V還可以染壞死細胞，因為這些細胞的膜破裂，使Annexin V可以進入整個質膜，但是Annexin V就無法區分壞細胞死（中晚期凋亡細胞）和早期凋亡細胞。因此，通過與碘化丙啶（PI）共染色，可以將凋亡細胞與壞死細胞（中晚期凋亡細胞）區分開，因為早期凋亡細胞和活細胞的細胞膜仍然完整，PI能進入壞死細胞（中晚期凋亡細胞）但是被早期凋亡細胞排除在外。該方案描述通過Annexin V結合和PI攝取，然后通過流式細胞儀檢測和量化凋亡細胞。

Annexin V/PI染色方法：

1）根據細胞類型，選擇合適的細胞板接種培養目的細胞；

2）用細胞毒性刺激物處理細胞或通過紫外線輻射觸發貼壁細胞死亡，使用明場顯微鏡觀察細胞；

3）收集細胞，將1 × 10⁵個細胞重懸于200μL Binding Buffer中，加入4μL 0.5 mg/mL PI和2μL Annexin V-FITC溶液；

4）避光室溫孵育15min；

5）用流式細胞儀進行熒光檢測。（Annexin V-FITC最大激發光為488 nm，發射光為520 nm。PI最大激發光為～535 nm，發射光為 617 nm。 但是，兩者都可以被488 nm激光激發。）

流式細胞術檢測：

通過Annexin V結合和PI攝取來測量細胞死亡。（A）以漫畫形式描述凋亡細胞Annexin V結合和PI攝取。（i）磷脂酰絲氨酸（PS）位于活細胞完整質膜的內部小葉上，這些細胞不會被Annexin V和PI染色。（ii）PS翻轉到凋亡細胞質膜的外部小葉，這些細胞在外部結合Annexin V，但仍不被PI染色。（iii）繼發性壞死細胞（中晚期凋亡細胞）膜破裂， Annexin V與質膜上的PS結合，PI被吸收并與DNA結合。（B）在流式數據的點圖中（左側）以及在用放線菌素D（1μM）處理16 h并用Annexin V染色的U937細胞的點圖中觀察到i，ii和iii中的種群的地方Annexin V-FITC和PI（右側）。

實驗過程中的小建議（大作用）：

1） 要準備陰性對照（不加染料）、陽性對照（同時加兩種染料）和單染樣品（分別只加一種染料），陽性對照和單染樣品細胞可以55℃水浴10min或用凋亡誘導劑誘導細胞凋亡。

2） 細胞凋亡檢測的是活細胞，切勿用甲醛固定，盡量避免酶消化時間過長或用力吹打產生細胞碎片，重懸細胞后盡快上機檢測。

3） Annexin V的結合依賴于鈣離子，所以消化液中避免含有EDTA，否則會影響Annexin V與PS的結合。

4） Annexin V的結合不穩定，所以需要在標記時確保使用含鈣離子的緩沖液，并且在半小時內上機檢測。

5） 如果細胞本身表達GFP或轉染了表達GFP的質粒，就會干擾FITC熒光信號，需選擇其他熒光標記的Annexin V，如Annexin V-PE，并且染色過程注意避光操作。

1）

右上象限（晚期凋亡）和右下象限（早期凋亡）中的H9c2細胞是凋亡細胞。上圖數據中表明，LPS組中H9c2細胞的凋亡率為27.5±0.56％，與對照組相比顯著增加（P <0.05）。 此外，在LPS + Gfi-1組中，轉染Gfi-1后，LPS誘導的H9c2細胞凋亡率降低了（12.3±0.37％），與LPS組的凋亡率相比明顯降低（P <0.05）。 這些數據強烈表明Gfi-1能減弱LPS誘導的H9c2細胞凋亡。

文獻鏈接：DOI: 10.1007/s10753-019-01095-x

2）

流式細胞儀分析用奧沙利鉑（抗腫瘤藥）處理48 h的HGC-27細胞在有或沒有轉染miR-374a-5抑制劑的時下細胞凋亡情況。上圖數據表明，與對照組（4.69％±0.24％）相比，抑制miR-374a-5p明顯誘導了細胞凋亡（9.42％±0.85％）。（Mock：未處理細胞；INC：抑制劑陰性對照；inhibitor：miR-374a-5p 抑制劑）

文獻鏈接：DOI:10.1016/j.omth.2019.07.025

3）

Annexin V

凋亡樣本兩色分析測定數據。右下象限中的細胞處于凋亡早期，右上象限中的細胞處于凋亡晚期，通常在測定時主要關注這兩個象限。（A）用抗Fas抗體（未用PI染色）處理過夜的Jurkat細胞。（B）Jurkat細胞用抗Fas抗體處理過夜，并用PI染色。（C）Jurkat細胞用抗Fas抗體處理過夜并用Annexin V染色。（D）Jurkat細胞用抗Fas抗體處理過夜并用Annexin V和PI染。（E）除了在1mM EDTA存在下進行染色以外，其他與D相同，說明EDTA影響了Annexin V與PS結合。

文獻鏈接：DOI: 10.1101/pdb.top093773

參考文獻

1. Crowley L C, Marfell B J, Scott A P, et al. Quantitation of Apoptosis and Necrosis by Annexin V Binding, Propidium Iodide Uptake, and Flow Cytometry[J]. Cold Spring Harb Protoc, 2016.

2. Wallberg F, Tenev T, Meier P. Analysis of Apoptosis and Necroptosis by Fluorescence-Activated Cell Sorting[J]. Cold Spring Harb Protoc, 2016.

3. Duensing T D, Watson S R. Assessment of Apoptosis (Programmed Cell Death) by Flow Cytometry[J]. Cold Spring Harb Protoc, 2018.

4. Zheng Y, Li S, Hu R, et al. GFI-1 Protects Against Lipopolysaccharide-Induced Inflammatory Responses and Apoptosis by Inhibition of the NF-kappaB/TNF-alpha Pathway in H9c2 Cells[J]. Inflammation, 2019.

5. Ji R, Zhang X, Gu H, et al. miR-374a-5p: A New Target for Diagnosis and Drug Resistance Therapy in Gastric Cancer[J]. Mol Ther Nucleic Acids, 2019, 18: 320-331.